[Laporan Genetika] PEMBUATAN ENZIM PROTEASE PAPAIN UNTUK ISOLASI DNA SEDERHANA

PEMBUATAN ENZIM PROTEASE PAPAIN UNTUK ISOLASI DNA SEDERHANA

ABSTRAK

Praktikum yang dilakukan di Laboratorium Pendidikan Biologi pada tanggal 7 januari 2013 ini bertujuan untuk menentukan keberhasilan isolasi DNA pada sel-sel hati ayam, melihat bentuk DNA melalui teknik isolasi DNA sederhana, dan mengidentifikasi tahap/fase isolasi DNA dan fungsinya. Pada praktikum ini menggunakan bahan berupa hati ayam, air es, garam dapur, daun papaya, sabun cair, etanol 70% dan kain kasa. Sedangkan alat yang digunakan yaitu lumpang-mortar, tabung reaksi, dan mikroskop. Tujuan pemberian air es pada cairan yaitu untuk menonaktifkan enzim yang terdapat pada daun pepaya maupun hati ayam agar tidak mengalami denaturasi pada saat penggerusan, tujuan pemberian garam dapur untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan kedua terpresipitasi dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lising buffer. Sementara pemberian sabun cair dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik sabun cair dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein kompleks Selain itu sabun cair dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan melisiskan isi sel.Tujuan pemberian etanol 70% yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat.Keberhasilan isolasi DNA ditandakan dengan adanya benang-benang putih yang bentuknya tak beraturan pada pengamatan di bawah mikroskop.

Kata Kunci:Isolasi DNA, DNA, Hati ayam

PENDAHULUAN

DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah,2005).

DNA tersusun seperti sebuah rantai yang dibuat dari unit-unit kecil (monomer) nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu: (1) sebuah basa nitrogen, baik berupa sebuah turunan pirimidin atau purin; (2) gula pentosa 2-deoksi-D-ribosa; dan (3) sebuah molekul asam fosfat (P). Empat basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin dan guanin (purine), cytosine dan thimine (pyrimidine). DNA dibentuk secara kovalen dari banyak deoksiribonukleotida; diikat oleh jembatan fosfodiester antara kelompok hidroksil dari fosfat pada satu nukleotida dengan kelompok hidroksil dari gula pada nukleotida berikutnya. Dan backbone DNA disusun oleh kelompok-kelompok fosfat dan gula pentosa secara bergantian, dengan basa-basa nitrogen pada sisi rantai (Elrod & Stansfield, 2002).

DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hydrogen dan antara nukleotida yang satu dengan yang lain dihubungkan dengan dengan ikatan fosfat (Campbell, 2004).

Bentukan pilinan ganda DNA dapat lepas satu sama lain membentuk rantai tunggal jika: (1) terdapat pada lingkungan dengan pH ekstrim; (2) terjadi peningkatan suhu; (3) penurunan konstanta dielektrik oleh alkohol, keton, dll.; dan (4) terkena urea atau amida. Selama proses denaturasi, ikatan kovalen yang menyusun struktur backbone DNA tidak rusak; ikatan yang putus adalah ikatan hidrogen antara pasangan basa dari kedua rantai. Ada dua kekuatan yang menjaga keutuhan pilinan ganda DNA, yaitu (1) ikatan hidrogen antara pasangan basa dan (2) interaksi hidrofobik antar basa yang berpasangan tersebut (Turner, 1997).

Saat ini banyak sekali metode isolasi DNA yang berhasil dikembangkan. Prinsip dasar dari isolasi DNA adalah mengeluarkan DNA dari sel yang selanjutnya dimanipulasi secara in vitro untuk berbagai keperluan. Untuk mengeluarkan isi sel tentu saja yang pertama kali dilakukan adalah menghancurkan bagian yang paling luar yaitu membran sel. Perlakuan harus berbeda ketika mengisolasi sel dari tumbuhan karena tumbuhan memiliki dinding sel. Selain itu, untuk menjaga kemurnian dari DNA yang diperoleh dilakukan juga perlakuan secara kimiawi untuk menghilangkan senyawa kontaminan yang dapat mengganggu tahap-tahap selanjutnya, misalnya kloning, reaksi pemotongan (restriksi), dsb (Old & Primrose, 1989).

Proses isolasiDNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun kimiawi. Jika dengan cara mekanik bisa dilakukan dengan memblender atau menggerus dengan menggunakan mortar dan pistil (Darbre, 1999).

Penambahan sabun cair dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena sabun cair dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik sabun cair dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein kompleks.

Garam memegang peranan penting yang lain untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan kedua terpresipitasi dan bersama-sama dengan sabun cair, keduanya berfungsi seperti halnya lising buffer. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Zubaidah, 2004).

METODE

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan Biologi FKIP Untan pada tanggal 7 Januari 2013. Adapun bahan yang digunakan berupa hati ayam, air es, garam dapur, daun papaya, sabun cair, etanol 70% dan kain kasa. Sedangkan alat yang digunakan yaitu lumpang-mortar, tabung reaksi, dan mikroskop.

Pertama-tama dilakukan pembuatan enzim protease papain dengan menggunakan daun pepaya yang diambil sebanyak 1 genggam dan kemudian dipotong kecil-kecil selanjutny daun tersebut digerus dalam lumpang dan mortar hingga halus dengan diberi air es. Air es terus ditambahkan untuk mempertahankan suhu dalam mortar agar tetap dingin. Selanjutnya setelah tumbukan halus, ditambahkan air es hingga volumenya setengah dari volume lumpang. Kemudian cairan daun pepaya tersebut disaring menggunakan kain kasa.

Setelah pembuatan enzim protease papain selesai dilakukan, maka selanjutnya dilakukan isolasi DNA dari hati ayam dimana hati ayam yang berukuran cukup besar dipotong-potong dan selanjutnya ditaruh dalam lumpang dengan diberi air es ke dalam lumpang agar suhunya tetap dingin. Setelah digerus, ditambahkan ½ sendok teh garam dapur ke dalam lumpang dan digerus hingga halus. Setelah selesai digerus, ditambahkan 1 sendok teh sabun cuci cair ke dalam lumpang dan diaduk hingga cairan menjadi kental dan berlendir. Selanjutnya didiamkan selama 15 menit dengan tetap mempertahankan suhu dingin dengan cara pemberian air es ke dalam lumpang. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml. Kemudian dipreparasi dengan enzim papain dengan perbandingan volume enzim papain: volume larutan hati ayam 1:1. Selanjutnya ditambahkan etanol 70% secara perlahan melalui dinding tabung hingga tampak bagian berwarna keputihan pada permukaan tabung reaksi. Diambil bagian tersebut untuk dilihat di bawah mikroskop. Selanjutnya digambar/ difoto dan dicatat bentuk yang diamati.

HASIL

Gambar 1. Ekstrak daun pepaya

Gambar 2. Ekstrak hati ayam

Gambar 3. Campuran ekstrak daun pepaya dan ekstrak hati ayam

PEMBAHASAN

Pada praktikum yang dilakukan kali ini, mengenai Isolasi DNA. Yang bertujuan untuk melihat DNA yang terdapat pada sel hati ayam.  Menurut Jamilah (2005) DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel. DNA tersusun seperti sebuah rantai yang dibuat dari unit-unit kecil (monomer) nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu: (1) sebuah basa nitrogen, baik berupa sebuah turunan pirimidin atau purin; (2) gula pentosa 2-deoksi-D-ribosa; dan (3) sebuah molekul asam fosfat (P). Empat basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin dan guanin (purine), cytosine dan thimine (pyrimidine). DNA dibentuk secara kovalen dari banyak deoksiribonukleotida; diikat oleh jembatan fosfodiester antara kelompok hidroksil dari fosfat pada satu nukleotida dengan kelompok hidroksil dari gula pada nukleotida berikutnya. Dan backbone DNA disusun oleh kelompok-kelompok fosfat dan gula pentosa secara bergantian, dengan basa-basa nitrogen pada sisi rantai. Umumnya DNA berbentuk double stranded namun adapula yang single stranded.

Langkah awal dalam isolasi DNA sederhana yang dilakukan adalah dengan mengekstraksi DNA dari sel hati ayam. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti yaitu dengan cara mekanik (melakukan penggerusan dengan mortar).

Adapun proses penambahan air es selama proses penggerusan adalah untuk membuat enzim yang ada pada ekstrak menjadi non aktif.

Menurut Zubaidah (2004) penambahan sabun cair dalam isolasi DNA dilakukan karena sabun cair dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik sabun cair dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein kompleks Selain itu menurut Jamilah (2005) sabun cair dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan melisiskan isi sel. Pada saat penghancuran jaringan- jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasansenyawa polifenol dan polisakarida.

Garam memegang peranan penting yang lain untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan kedua terpresipitasi bersama-sama dengan sabun cair, keduanya berfungsi seperti halnya  lysing buffer. Selain itu, penambahan garam bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati dan untuk memberikan kondisi ionik sehingga reaksi berjalan lebih stabil serta dapat membantu dalam hal pemekatan DNA.

Fungsi dari penambahan alkohol (etanol 70%) yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu alkohol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Sehingga terlihat isolat yang diperoleh adalah DNA dimana hal tersebut menandakan keberhasilan dalam melakukan isolasi DNA pada sel hati ayam.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil percobaan pada praktikum  isolasi DNA sederhana dengan menggunakan hati ayam didapatkan hasil berupa bagian berwarna keputihan yang setelah diamati dibawah mikroskop terlihat seperti rangkaian benang-benang kusut yang menandakan bahwa isolasi DNA yang dilakukan pada sel-sel hati ayam berhasil.

REFERENSI

Campbell NA, dkk, 2004. Biologi. Edisi Kelima. Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Darbre, Philippa D. 1999. Basic Molecular Biology (Essential Techniques). London: John Wiley & Sons.

Elrod & Stansfield. 2002. Schaum’s Outline Teori dan Soal-Soal Genetika. Jakarta: Erlangga.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan

Ekstrak Nanas (Ananas Comosus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai  Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:Universitas Negeri Malang.

Old, RW & Primrose, SB. 1989. Principles of Gene Manipulation 4th ed.

Oxford: Blackwell Scientific

Publications.

Turner, PC., McLennan, AG., Bates,AD., & White, MRH. 1997. Instant Notes in Molecular Biology. Singapore: Bios Scientific Publisher.

Zubaidah, Siti.2004.Identifikasi variasi genetik,distribusi dan upaya eliminasi bakteri penyebab CVPD ( Citrus Vein Phloem Degeneration ). Desertasi tidak diterbitkan. Malang : Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya.