[Laporan Praktikum Anatomi & Fisiologi Tumbuhan] PENENTUAN KADAR KLOROFIL SECARA SPEKTROSKOPI

ABSTRAK

Spektrofotometer merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Salah satu kegunaannya yaitu dalam penentuan kadar klorofil daun. Pada praktikum kali digunakan daun bayam (Amaranthus spinosus) dengan usia yang berbeda yaitu daun muda, daun setengah tua, dan daun dewasa yang diekstrak terlebih dahulu. Pada hasil percobaan dan perhitungan diperoleh hasil kadar klorofil total tertinggi terdapat pada daun bayam usia setengah tua yaitu  5,07 mg/l, sedangkan kadar klorofil total daun bayam muda 2,65 mg/l dan kadar klorofil daun bayam dewasa 4,66 mg/l. Pada semua  daun bayam dengan umur yang berbeda memiliki kadar klorofil a yang lebih tinggi dibandingkan kadar klorofil b.

Kata Kunci: Klorofil, Spektrofotometer, Daun bayam (Amaranthus spinosus)

A. PENDAHULUAN

a). Latar Belakang

Spektrofotometer merupakan alat yang memiliki harga yang sangat mahal dan dalam penggunaannya harus dilakukan secara hati-hati. Untuk itulah praktikan perlu menguasai cara penggunaan alat tersebut dengan baik. Salah satu kegunaan dari alat ini yaitu untuk penentuan kadar klorofil.

Kadar klorofil setiap jenis tumbuhan berbeda-beda. Bahkan dalam tumbuhan satu spesies pun memiliki kadar klorofil yang berbeda. Perbedaan kadar klorofil ini salah satunya dipengaruhi oleh umur daun suatu jenis spesies.

Kadar klorofil yang optimal dalam daun suatu tumbuhan sangat baik untuk memperlancar kelangsungan proses fotosintesis.

Pada praktikum kali ini digunakan daun bayam (Amaranthus spinosus) yang usianya berbeda-beda untuk penentuan kadar klorofilnya dengan bantuan alat spektrofotometer.

b). Dasar Teori

Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman, Algae dan Cynobacteria. nama "chlorophyll" berasal dari bahasa Yunani kuno : choloros = green (hijau), and phyllon= leaf (daun). Fungsi krolofil pada tanaman adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat (gula menjadi pati), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari (Subandi, 2008).

Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sitesis molekul makanan dalam kloroplas. Kloroplas ditemukan terutama dalam sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut stomata (Campbell, 2003).

Klorofil merupakan zat hijau daun yang terdapat pada semua tumbuhan hijau yang berfotosintesis. Berdasarkan penelitian, klorofil ternyata tidak hanya berperan sebagai pigmen fotosintesis. Proses fotosintesis membutuhkan klorofil, maka klorofil umumnya disintesis pada daun untuk menangkap cahaya matahari yang jumlahnya berbeda pada tiap spesies tergantung dari faktor lingkungan dan genetiknya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis klorofil meliputi: cahaya, gula atau karbohidrat, air, temperatur, faktor genetik dan unsur-unsur nitrogen, magnesium, besi, mangan, Cu, Zn, sulfur, dan oksigen.

Faktor utama pembentuk klorofil adalah nitrogen (N). Unsur N merupakan unsur hara makro. Unsur ini diperlukan oleh tanaman dalam jumlah banyak. Unsur N diperlukan oleh tanaman, salah satunya sebagai penyusun klorofil. Tanaman yang kekurangan unsur N akan menunjukkan gejala antara lain klorosis pada daun. Tanaman tidak dapat menggunakan N₂ secara langsung. Gas N₂ tersebut harus difiksasi oleh bakteri menjadi amonia (NH₃) (Hendriyani dan Setiari, 2009).

Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b. perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol (Santoso, 2004).

Antara klorofil a dan klorofil b mempunyai struktur dan fungsi yang berbeda, dimana klorofil a di samping bisa menyerap energi cahaya, klorofil ini juga bisa merubah energi cahaya dan tidak bisa merubahnya menjadi energi kimia dan energi itu akan ditransfer dari klorofil b ke klorofil a. Klorofil b ini tidak larut dalam etanol tapi dapat larut dalam ester, dan kedua jenis klorofil ini larut dalam senyawa aseton (Devlin, 1975).

Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah sekitar 1% basis kering. Dalam daun klorofil banyak terdapat bersama-sama dengan protein dan lemak yang bergabung satu dengan yang lain. Dengan lipid, klorofil berikatan melalui gugus fitol-nya sedangkan dengan protein melalui gugus hidrofobik dari cincin porifin-nya. Rumus empiris klorofil adalah C₅₅H₇₂O₅N₄Mg (klorofil a) dan C₅₅H₇₀O₆N₄Mg (klorofil b) (Subandi, 2008).

Dari semua radiasi matahari yang dipancarkan, hanya panjang gelombang tertentu yang dimanfaatkan tumbuhan untuk proses fotosintesis, yaitu panjang gelombang yang berada pada kisaran cahaya tampak (380-700 nm). Cahaya tampak terbagi atas cahaya merah (610 - 700 nm), hijau kuning (510 - 600 nm), biru (410 - 500 nm) dan violet (< 400 nm). Masing-masing jenis cahaya berbeda pengaruhnya terhadap fotosintesis. Hal ini terkait pada sifat pigmen penangkap cahaya yang bekerja dalam fotosintesis. Pigmen yang terdapat pada membran grana menyerap cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Pigmen yang berbeda menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda (Pratama, 2009).

Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer akan menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang punya spesifikasi melewati banyaknya panjang gelombang tertentu (Noggle dan Fritz, 1979).

c). Masalah

Adapun permasalahan yang terdapat pada praktikum Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektroskopi yaitu tentang bagaimana cara penggunaan spektrofotometer yang baik dan benar dalam penentuan kadar klorofil daun bayam (Amaranthus spinosus).

B. TUJUAN

Tujuan praktikum Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektoskopi adalah untuk mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektofotometer yaitu dalam penentuan kadar klorofil daun bayam (Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda.

C. MATERIAL DAN METODA

a). Waktu dan Tempat

Melaksanakan praktikum  Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektoskopi ini di Laboratorium Pendidikan Biologi FKIP UNTAN pada hari Sabtu, 19 Mei 2012 dari pukul 07.30 hingga pukul 09.30 WIB.

b). Alat dan Bahan

Alat yang digunakan yaitu mortar dan alu, gelas ukur, saringan Buchner, cuvet, pipet tetes, dan spektrofotometer. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu daun bayam (Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda, aseton 80%, aluminium foil, dan akuades.

c). Cara Kerja

Mula-mula untuk mengukur kadar klorofil dari daun bayam (Amaranthus spinosus) yang umurnya berbeda-beda, maka diambil patokan sebagai berikut: daun umur muda diambil daun pada pucuk, daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk, dan daun dewasa diambil daun nomor 5 ke bawah.

Selanjutnya 1gr daun yang masih segar dirajang kecil-kecil. Rajangan diekstrak dengan aceton 60% sebanyak 100 ml, dengan cara menggerusnya di dalam mortal selama 5 menit. Yakinkan bahwa semua pigmen klorofil dari daun telah keluar seluruhnya yang dapat dilihat dari ampasnya yang berwarna putih. Kemudian praktikan menyaring ekstrak klorofil dengan saringan Buchner dan selanjutnya memasukkannya ke dalam labu ukur 100 ml. Selanjutnya praktikan memasukkannya ke dalam tabung reaksi dan menutup tabung dengan menggunakan aluminium foil dan dibiarkan selama 1 minggu. Setelah 1 minggu, praktikan mengukur kadar klorofilnya menggunakan spektrofotometer. Dengan menggunakan cuvet, Optica Density (OD) dari ekstrak diukur dengan panjang gelombang 663nm dan 645nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan membandingkan OD pada 663nm dan 645nm dalam sel yang tebalnya 1cm dengan menggunakan koefisien absorbs apesifik yang telah ditentukan oleh Mac Kinner (1941) sebagai berikut :

Klorofil Total (mg/l)    = 20,2 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

Klorofil a                     = 12,7 D₆₆₃ + 2,69 D₆₄₅

Klorofil b                    = 22,9 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

D. DATA PENGAMATAN

Jenis Daun	Panjang Gelombang	Absorbsi	Klorofil
			a	b	Total
Muda	645	0.131	4,07	2,99	2,65
	663	0.293
1/2 tua	645	0.251	5,86	5,76	5,07
	663	0.408
Dewasa	645	0.231	5,76	5,29	4,66
	663	0.405

Gambar 1.1  spektofotometer merk SHIMADZU

Gambar 1.2 Tempat meletakkan cuvet

Gambar 1.3 Proses pengkalibrasian spektrofotometer

Gambar 1.4 Layar monitor spektrofotometer yang sedang menunjukkan jumlah kadar klorofil dari panjang gelombang yang telah dipilih

E. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini untuk penentuan kadar klorofil menggunakan daun bayam (Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda yaitu daun umur muda yaitu daun yang diambil pada pucuk, daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk, dan daun dewasa yaitu daun nomor 5 kebawah.  Masing-masing daun tersebut diekstrak dan ekstrak tersebut dibiarkan selama 1 minggu. Setelah diekstrak, terlihat jelas perbedaan warna ekstrak dari daun yang berbeda usianya. Untuk warna ekstrak tercerah didapat pada daun setengah tua.

Selanjutnya dilakukan penentuan kadar klorofil dengan menggunakan alat yang disebut dengan spektrofotometer. Harga alat ini sangat mahal sehingga dalam penggunaannya perlu dilakukan secara hati-hati.

Untuk menggunakan alat tersebut pertama isi akuades pada cuvet yang nantinya akan dijadikan sebagai blanko, kemudian diletakkan pada spektofotometer dengan hati-hati dan selanjutnya ditekan tombol zero untuk mengkalibrasi alat tersebut. Selanjutnya isi cuvet lainnya dengan ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang ada. Masukkan 1 cuvet berisi ekstrak daun bayam ditempat cuvet berisi akuades diletakkan sebelumnya sedangkan cuvet berisi akuades dipindahkan pada posisi diatas cuvet berisi ekstrak daun bayam. Lalu spektofotometer kembali dikalibrasi. Setelah pengkalibrasian selesai, maka dipilih panjang gelombang yang diinginkan yang tertera pada  monitor spektrofotometer. Klorofil yang terkandung pada ekstrak daun bayam tersebut selanjutnya akan ditembakkan sesuai dengan panjang gelombang yang telah dipilih dan nantinya akan terlihat nilai kadar klorofil dari ekstrak daun bayam yang diukur pada monitor.

Dari hasil percobaan dan perhitungan yang dilakukan diperoleh bahwa kadar klorofil yang paling banyak terdapat pada daun bayam yang berusia setengah tua yaitu 5,07 mg/l, sedangkan pada daun bayam yang berusia muda 2,65mg/l dan daun bayam usia dewasa 4,66 mg/l.

Adapun rumus yang digunakan untuk menghitung klorofil total yaitu:

Klorofil Total (mg/l)    = 20,2 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

Diperolehnya hasil tersebut dapat dikarenakan pada daun bayam berusia setengah tua memiliki kadar klorofil yang paling maksimal karena pada usia ini daun melakukan proses fotosintesis secara aktif sedangkan pada daun muda diperoleh hasil kadar klorofil terendah dikarenakan kadar klorofil yang terbentuk masih sedikit dan masih dalam proses pembentukan, selanjutnya pada daun dewasa kadar klorofilnya sudah sedikit berkurang dibandingkan dengan daun setengah tua. Hal ini dapat terjadi karena rusaknya klorofil yang ada.

Dari hasil percobaan juga diperoleh hasil bahwa dari ketiga ekstrak daun bayam dengan umur yang berbeda diperoleh kadar klorofil a lebih tinggi dibandingkan dengan kadar klorofil b. Hal ini sesuai dengan pernyataan Subandi (2008) bahwa Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil.

Untuk menghitung klorofil a dan klorofil b menggunakan rumus:

Klorofil a                     = 12,7 D₆₆₃ + 2,69 D₆₄₅

Klorofil b                    = 22,9 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

Jadi setelah melakukan praktikum ini praktikan dapat mengetahui dan menggunakan spektofotometer sesuai prosedur yang benar dalam satu diantara kegunaanya yaitu penentuan kadar klorofil.

F. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum Penentuan Kadar Klorofil secara Spektoskopi maka dapat disimpulkan bahwa kadar klorofil total tertinggi didapatkan pada ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang berusia setengah tua sebesar 5,07 mg/l. Sedangkan pada daun dewasa 4,66 mg/l dan daun muda hanya 2,65 mg/l.

Selanjutnya diperoleh bahwa kadar klorofil a pada semua ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) lebih tinggi nilainya dibandingkan dengan kadar klorofil b.

Dan dalam penggunaan spektrofotometer harus dilakukan secara hati-hati karena alat tersebut sangat sensitif dan jangan lupa untuk mengkalibrasi terlebih dahulu sebelum menggunakannya.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Neil A. Biologi. 2003. Jakarta: Erlangga.

Devlin, Robert M. 1975. Plant Physiology Third Edition. New York : D. Van Nostrand.

Hendriyani, Ika Susanti dan Setiari, Nintya. 2009. Kandungan Klorofil dan Pertumbuhan Kacang Panjang  (Vigna sinensis) pada Tingkat Penyediaan Air yang Berbeda. J. Sains & Mat. Vol  17 No. 3, Juli 2009: 145-150.  http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:mfANPEqVi0kJ:eprints.undip.ac.id/2335/1/artikel_jsm_nintya.pdf+Klorofil+pdf&h. (Diakses pada  17 Mei 2012).

Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi : Mall of India Private Ilmited.

Pratama, Tomi Anugrah. 2009. Fotosintesis. http://thetom022.files.wordpress.com/2009/06/fotosintesis.pdf . (Diakses pada  17 Mei 2012).

Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu : Universitas Muhammadiyah Bengkulu.

Subandi, Aan. 2008. Metabolisme. http://metabolisme.blogspot.com/2007/09. (Diakses pada  17 Mei 2012).

LAMPIRAN

Jenis Daun	Panjang Gelombang	Absorbsi	Kadar Klorofil (mg/l)
			a	b	Total
Muda	645	0.131	4,07	2,99	2,65
	663	0.293
Setengah Tua	645	0.251	5,86	5,76	5,07
	663	0.408
Dewasa	645	0.231	5,76	5,29	4,66
	663	0.405

Rumus:

Klorofil Total (mg/l)    = 20,2 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

Klorofil a                     = 12,7 D₆₆₃ + 2,69 D₆₄₅

Klorofil b                    = 22,9 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

Daun Muda   :

Klorofil Total  = (20,2 x 0,131) + (0,02 x0.293)

                        = 2,6462 + 0,00586     = 2,65 mg/l

Klorofil a         = (12,7 x0.293) + (2,69 x0.131)

                        = 3,7211 + 0,35239     = 4,07 mg/l

Klorofil b        = (22,9 x 0.131) + (0,02 x0.293)

                        = 2,9999 + 0,00586     = 2,99 mg/l

Daun Setengah Tua  :

Klorofil Total  = (20,2 x0.251) + (0,02 x0.408)

                        = 5,0702 + 0,00816     = 5,07 mg/l

Klorofil a         = (12,7 x0.408) + (2,69 x0.251)

                        = 5,1816 + 0,67519     = 5,86 mg/l

Klorofil b        = (22,9 x0.251) + (0,02 x0.408)

                        = 5,7479+ 0,00816      = 5,76 mg/l

Daun Dewasa            :

Klorofil Total  = (20,2 x0.231) + (0,02 x 0.405)

                        = 4,6662 + 0,0081       = 4,66 mg/l

Klorofil a         = (12,7 x0.405) + (2,69  x0.231)

                        = 5,1435 + 0,62139     = 5,76 mg/l

Klorofil b        = (22,9 x0.231) + (0,02 x0.405)

                        = 5,2899+ 0,0081        = 5,29 mg/l